Développement de thérapie génique par CRISPR/Cas9 appliquée aux myopathies liées à RYR1

Le mardi 31 janvier 2023, Mathilde BEAUFILS soutiendra sa thèse intitulée " Développement de thérapie génique par CRISPR/Cas9 appliquée aux myopathies liées à RYR1".

Cette thèse a été dirigée par Isabelle Marty de l'équipe "Myologie cellulaire et Pathologies" du GIN.

Composition du jury :

• Dr Mireille COSSEE, MCU-PH, Institut Universitaire de Recherche Clinique, Montpellier - Rapporteure
• Dr Marc BITOUN, DR, Centre de Recherche en Myologie, Paris Sorbonne Université - Rapporteur
• Dr Marc BARTOLI, DR, Centre de Génétique Médicale, Marseille- Examinateur
• Pr Charles COUTTON, PU-PH, Laboratoire de Génétique Chromosomique, CHUGA Grenoble - Examinateur
• Dr John RENDU, MCU-PH, Institut des Neurosciences, Grenoble - Examinateur
• Dr Isabelle MARTY, DR, Institut des Neurosciences, Grenoble - Directrice de Thèse

Résumé :

La contraction des cellules dans le muscle squelettique est constituée d’une succession d’étapes finement régulées. L’excitation de la fibre musculaire par un motoneurone conduit à une libération de calcium du réticulum sarcoplasmique vers le cytoplasme par un canal calcique : le récepteur à la ryanodine de type 1 (RyR1). Ce relâchement de calcium par RyR1 engendre la contraction des unités contractiles de la cellule. Les myopathies liées à RYR1 sont un groupe de pathologies génétiques, toutes dues à au moins une mutation dans le gène RYR1 codant pour le canal calcique du même nom. Ces pathologies ont comme point commun une faiblesse musculaire chez les patients, la sévérité pouvant être modérée à sévère suivant les cas. Il n’existe actuellement aucun traitement pour ces pathologies.
Dans une première étude, notre équipe a fait la démonstration d’une approche de thérapie par saut d’exon via l’utilisation d’oligonucléotides antisens. Malgré des résultats très satisfaisants, cette approche n’a pas pu être développée vers la clinique en raison de l’aspect ultra personnalisé de l’approche. Ce travail de thèse s’inscrit à la suite de cette étude, avec pour objectif de développer une approche moins personnalisée où un même traitement serait donc applicable à plus de patients. Pour se faire, nous avons utilisés CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR associated protein 9).
Dans un premier temps, nous avons développé une stratégie de délétion intronique applicable à la même famille de patients que dans la première étude menée par l’équipe. À travers ce projet, nous avons réalisé la délétion attendue de l’intron ciblé dans des cellules de patients immortalisées. De plus, nous avons démontré la maitrise de la production de la nucléase dans le but de limiter au maximum l’activité off‑target.
Dans un second temps, nous avons utilisé un protocole similaire pour développer de nouveaux modèles cellulaires à partir de myoblastes immortalisés issus d’un sujet sain. Les cellules ont été traitées par CRISPR/Cas9 puis clonées dans le but d’obtenir de nouvelles lignées dans lesquelles un gène d’intérêt a été éteint. Ces modèles cellulaires constituent de nouveaux outils pour l’étude du couplage excitation‑contraction, aussi bien dans un contexte physiologique que pathologique.
Dans un troisième temps, nous avons développé une approche thérapeutique indépendante des mutations des patients. Cette approche vise des variants relativement courants dans la population générale et qui ont été identifiés sur l’allèle porteur d’une mutation chez une patiente atteinte de myopathie liée à RYR1. En permettant la délétion spécifique de cet allèle muté en utilisant CRISPR/Cas9, cette approche pourrait ainsi être applicable à tous les patients atteints de myopathies liées à RYR1 en raison d’une mutation à transmission dominante. De plus, cette approche pourrait également être applicable, sous certaines conditions, à d’autres pathologies.