Comprendre l'interaction fonctionnelle de VASH-SVBP avec les microtubules et leur régulation par la phosphorylation

Le jeudi 4 juillet 2024, Chadni SANYAL soutiendra sa thèse intitulée "Comprendre l'interaction fonctionnelle de VASH-SVBP avec les microtubules et leur régulation par la phosphorylation".

Cette thèse a été dirigée par Marie-Jo MOUTIN de l'équipe "Neuropathologies et Dysfonctionnements Synaptiques" du GIN.

Composition du jury

- Charlotte Aumeier, rapporteure, Université de Genève
- Coralie Fassier, rapporteure, Inserm, Paris Ile-de-France Centre Est
- Lucie Carrier, examinatrice, Universitätsklinikum Hamburg Eppendorf 
- Didier Portran, examinateur, CNRS, délégation Occitanie Est
- Rémy Sadoul, examinateur, UGA
- Marie-Jo Moutin, Directrice de thèse, CNRS, délégation Alpes

Résumé

Les microtubules (MT) sont des composants essentiels du cytosquelette eucaryote, formés de dimères de tubuline alpha (α) et bêta (β). Ils jouent un rôle crucial dans diverses fonctions cellulaires telles que la division, la motilité et la morphogenèse, et sont particulièrement importants pour le développement des neurones et la contraction des cardiomyocytes. Les MT sont régulées par le ''code tubuline'', qui englobe les variations de la composition de l'hétérodimère α/β tubuline par le biais des isoformes de tubuline et de leurs modifications post-traductionnelles (PTM).L'une des PTM d'intérêt est le cycle de détyrosination/tyrosination au cours duquel le résidu tyrosine C-terminal de l'α-tubuline est succéssivement éliminer et ré-additionné. Il est piloté par les enzymes tubuline carboxypeptidases (TCP) et tubuline tyrosine ligase (TTL). En 2017, notre groupe a identifié les complexes VASH1/2-SVBP (vasohibine et son chaperon, la petite protéine de liaison à la vasohibine) comme étant des TCPs majeures. Des déséquilibres dans ce cycle sont liés à des maladies telles que la neurodégénérescence et l'insuffisance cardiaque. Suite à l'élucidation de la structure cristalline de VASH-SVBP en 2019, l'objectif de mon doctorat était de comprendre les mécanismes régissant l'interaction de l'enzyme avec les MTs et leur régulation.Grâce à la microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (TIRF-M) à molécule unique et à des essais d'activité de détyrosination, et en utilisant plusieurs mutants tronqués et chimères, nos résultats ont dévoilé des schémas de liaison distincts pour VASH1 et VASH2 sur les MTs stabilisées par le taxol. VASH1 présente une détyrosination globale, tandis que VASH2 a une activité très localisée. Ce comportement est attribué aux interactions de leurs régions N- et C-terminales désordonnées avec les MTs. La région N-terminale de VASH2 est responsable de son temps de résidence plus long et de sa diffusion moindre sur les MT, ce qui explique son activité localisée. En revanche, pour VASH1, la région N-terminale contribue à la diffusion et au détachement du complexe enzymatique des MT avec un temps de séjour plus court, conduisant à une activité plus globale.Un examen plus approfondi a révélé que les interactions électrostatiques jouent un rôle central dans les mécanismes d'action distincts des deux complexes. Cela laisse entrevoir l'impact possible de la phosphorylation sur le comportement de ces enzymes. En utilisant des études in vitro, nous avons révélé qu'une kinase spécifique peut phosphoryler le domaine C-terminal de VASH1 et les domaines C- et N-terminaux de VASH2, qui sont également leurs domaines d'interaction avec les MTs. Grâce à une analyse par spectrométrie de masse et l'utilisation de mutants, nous avons mis en évidence un site important de phosphorylation de VASH1 qui régule son activité et sa liaison au microtubules. Ces résultats pourraient avoir des implications majeures dans les neurones et les cardiomyocytes.En résumé, les recherches que j'ai menées au cours de mon doctorat ont permis de comprendre comment les microtubules sont modifiés différemment par les enzymes de détyrosination VASH1/2-SVBP et comment la phosphorylation est un mécanisme de régulation de leur fonction.